無基質（Scaffold-Free）3D細胞球體的制備解析-上海溪拓科學儀器有限公司

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無基質（Scaffold-Free）3D細胞球體的制備解析

更新時間：2023-02-21

細胞在體內緊密的空間排列使得單個細胞之間以及細胞與細胞外基質之間能夠進行復雜的相互作用。這種排列為細胞提供了的線索，以指導特定的細胞功能和生長。為了在體外復制這種空間排列，可以在三維（3D）培養系統中培養細胞，使細胞與細胞聚集形成球體。讓細胞聚集成細胞球體的無基質（SCAFFOLD-FREE）3D細胞球體培養是構建3D細胞球較為常見的方法。其原理基于貼壁細胞趨向于聚集的生物特性，如腫瘤細胞、肝細胞等。

現階段，已有多種方法構建細胞球體，如維持細胞在培養基中的懸浮培養（懸滴法、磁懸浮法、旋轉培養法），或是利用低粘附孔板（U型板等）。不同的培養方法優缺點是怎樣的？該如何選擇？相應的3D細胞球體檢測和分析方法有哪些？本期，EFL從3D細胞球體的制備、檢測及應用三方面進行闡述，供大家參考與學習。

Scaffold-Free 3D 細胞球體制備方法

1. 懸滴法

簡介：細胞通過重力沉積在懸掛液滴的底部，并逐漸形成球狀體。將一小滴細胞懸液（體積為10-30μL）種植在微孔板的蓋子上，然后將微孔板倒置，使細胞在重力作用下積聚在液滴的底部。

優點：具有高通量制備細胞球狀體的潛力。

缺點：懸滴法通常涉及小體積液體操作，定期更換培養基和細胞染色都需要較高的實驗操作技能。此外，它耗時且勞動密集，難以實現3D多細胞球體的長期培養。

2. 磁懸浮

簡介：利用磁場將含有納米顆粒的氧化鐵細胞團簇在一起形成球狀體。

優點：可控制細胞群的幾何形狀，能實現不同種細胞在共培養過程中的多細胞聚集。

缺點：細胞球體的大小和形狀難以控制，均勻性差。

3. 旋轉培養

簡介：通過模擬微重力將細胞保持在動態液體中。沿其水平軸旋轉培養容器以混合細胞。通過調節反應器的速度，可以將流體沖擊力和剪切力降至。形成3D細胞球體后，反應器繼續以特定速度旋轉，以防止球體相互聚結。

優點：可模擬人體內的動態條件，適用于細胞的長期培養，便于大規模生產等。

缺點：培養系統依賴性大，培養對象只能是各相同性的組織和器官，如軟骨、肝等，不適于各相異性的組織器官。

4. 超低粘附 U 型底多孔板

簡介：非貼壁表面方法使細胞聚集成球狀體，盡可能的降低細胞貼附、蛋白吸收和酶活性，維持細胞以懸浮不貼壁的狀態生長。

優點：非粘附表面培養方法方便簡潔，可實現3D球體的長期培養和異質細胞的共培養。

缺點：對細胞活性要求較高，并不適用于所有細胞形成細胞球。

細胞球體檢測方法

1. 形態分析

光學顯微鏡：可測量直徑、面積、周長、固體度、圓度和球形度等屬性。

電子顯微鏡可以觀察到粗糙度、孔隙、通道和其他參與細胞-細胞相互作用的結構，存在結構倒塌、制備和鍍金步驟導致球體形態發生變化的風險。

聚焦離子束掃描電子顯微鏡(FIB-SEM)可自動生成z軸分辨率較高的三維圖像，近年來已被應用于大尺度三維球體成像。

透射電鏡技術則用于更詳細地分析球體中的超微結構區室。

2. 細胞活力定性分析，用于三維內部結構和細胞周期的表征

共聚焦激光掃描顯微鏡：可以觀察球體的不同層，對于光線穿透受阻的大球體的分析不太有效，可通過將球體冷凍切片來解決。然而，由于切割過程本身，切片可能會產生三維結構的形態畸變，需要使用軟件工具將切片連接起來，重建完整的球體圖像。

光片熒光顯微鏡(LSFM)：不需要樣品切片就可觀察樣品3D結構，能夠穿透更深的樣品。但雙光子的信號很弱，采集速度非常慢，不適合對大樣品進行動態成像，其成本較昂貴。

雙光子和多光子顯微鏡系統：具有超高靈敏度的直接探測器能記錄組織深層最細微的內部結構，可有效地收集來自深層組織的微弱光子，使圖像更明亮。

3. 球狀體中活細胞的定量

球狀體中活細胞的數量可以通過直接方法(如手動或自動計數)和間接方法(通過比色法和生物發光測定)來確定。

直接法：球體必須分解成單獨的細胞，這一過程的難度取決于組成球體的細胞類型以及細胞產生的ECM的特征。

間接法包括比色法和生物發光法。比色法基于細胞攝取染色劑的能力，當分離或聚集成球狀時，球體內化合物擴散的定量方法可能會顯示差異。生物熒光法被證明更可靠、更敏感、顯色化合物干擾更低、速度更快，因為不需要染色潛伏期，而使用其他方法時可能需要幾個小時。

具體的檢測方法可參考往期EFL推文“細胞增殖與活性檢測的“規矩"?總有一條適用你"

4. 基因表達譜

蛋白質印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot可識別細胞裂解液中轉錄的蛋白質的存在，它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。

5. 細胞代謝

目前用于分析球形代謝功能的分析可以使用分析細胞外流的設備，并通過細胞外酸化率測量糖酵解，通過耗氧率測量氧化磷酸化。

6. 人類細胞圖譜（HCA）

HCA方法，這項技術是提高圖像捕獲效率、圖像處理算法和開發可靠的數據分析軟件的結果。HCA有潛力應用于單個細胞、構成球體的一組特定亞群或整體聚集的熒光標記的分析，而不需要細胞分離。HCA需要自動顯微鏡，通常是熒光或共聚焦顯微鏡，以及強大的數據分析和存儲軟件，這導致初始投資很高。

細胞球體應用

1、藥物療效和毒性試驗:藥物篩選

2、器官發育和先天性疾病的探究

3、大規模組織工程的發展：生物制造

4、生物3D打印

5、增加系統復雜性:微流體和高通量平臺